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本品以粉末形式提供，可与碘化丙啶PI（货号：KM0012）联合使用，进行活细胞和死细胞的双重染色。

Calcein,AM，一种具细胞膜渗透性的活细胞荧光染料，呈绿色荧光（Ex/Em= 490nm/515nm）。AM基团的存在不仅加强疏水性，使其能轻易穿透活细胞膜。而且封闭结合钙离子的分子部分，本身不发荧光。一旦进入细胞后，被细胞内酯酶水解为钙黄绿素，能与胞内钙离子结合，产生强烈的绿色荧光。因不具有细胞膜渗透性，从而被保留在胞内。与其它活细胞染料（如BCECF-AM，CFDA）相比，Calcein,AM最适合用于活细胞染色探针，因细胞毒性很低，而且不会抑制任何细胞功能如增殖或淋巴细胞趋化性。另外，使用Calcein,AM活性检测的实验结果十分可信，与标准的51Cr释放法所得结果一致。

由于死细胞缺乏酯酶，Calcein,AM仅对活细胞进行标记，这一特征使其非常适合用来检测细胞活力和细胞的短期示踪。常常与碘化丙啶PI联合使用，因其仅能穿过死细胞膜的无序区域到达细胞核，嵌入细胞的DNA双螺旋区域，并产生红色荧光（Ex/Em= 535nm/617nm），仅对死细胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。用545nm激发，仅可观察到死细胞。结合这些特点，Calcein,AM和PI经常被结合用作活细胞和死细胞的双重染色。

• 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
  
• 乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后请在干燥的环境放至室温后再开封。由于试剂微量，开封前请将其短暂离心，以保证粉末落入管底。
  
• Calcein,AM对湿度非常敏感，粉末保存一定要保持干燥。Calcein,AM储存液需要分装避光冻存，且必须紧紧密封盖子，干燥保存。Calcein,AM工作液必须现配现用。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

• 储存液制备
  储存液配制范围可为1～5mM，具体根据工作浓度来决定，建议提前配制成1000×储存液。若使用的工作液为5μM，那么可配制5mM的储存液，即往50μgCalcein,AM（Mw：994.86）内加入10μL细胞培养级别的DMSO（货号：KM0186）即可。
  
• 20% Pluronic F-127制备（可选）
  称取100mgPluronic F-127粉末（货号：KM0188）中加入500μL DMSO，配制成20%(w/v)DMSO母液。溶解过程需要在40～50℃加热20～30min。溶液室温保存，不用冷藏。如有结晶析出，可以重新加热后溶解，不影响使用。
  
• 染色步骤
  大多数实验体系中Calcein,AM的工作浓度为2～5μM。由于不同细胞系的最佳染色条件不同，初次实验建议做梯度实验，以确定Calcein,AM的最佳工作浓度，以最低的探针浓度得到最好的荧光结果为筛选原则。
  
  • 取一管适量分装的储存液（1000×）置于室温，至少回温20min，低速离心后，用合适的缓冲液如PBS，HBSS-HEPES稀释到1×染色工作液。
    注意：有时可添加一定量的非离子表面活性剂如Pluronic F127到Calcein AM储存液内来增强其水溶性。制备染色工作液前，取一管Calcein AM储存液内加入等体积的20%Pluronic F127，使Pluronic F127的终浓度为0.02%。加入Pluronic F127的Calcein AM溶液不可长期保存，需现配现用。
    
  • 对于贴壁细胞，先用胰酶-EDTA消化细胞，离心收集细胞（1000rpm，3min）。对于悬浮细胞，直接离心收集细胞。
    
  • 去上清，用PBS（或者其他缓冲液）清洗细胞2～3次，以充分去除残留的酯酶活性。
    
  • 用1/10细胞培养基体积的Calcein,AM染色工作液重悬细胞，37℃孵育15～30min。
    注意：若细胞自身含有机阴离子转运体，需加入丙磺舒（1～2.5mM）或者苯磺唑酮（0.1～0.25mM）到孵育体系内以降低Calcein泄露到胞外。
    
  • 用PBS（或者其他缓冲液）洗涤细胞两次去除多余染料。
    注意：如有必要，使用含有机阴离子转运抑制剂的缓冲液来进行细胞清洗。用含合适滤光片（Ex/Em= 490nm/515nm）的荧光显微镜进行检测。